تکنیک PCR و نکاتی کلیدی درباره آن

آیا ترموسایکلر و PCR یکسان هستند؟

پاسخ سوال آیا ترموسایکلر و pcr یکسان هستند؟ کلمه خیر است. در واقع ترموسایکلر (Thermo Cycler)یا ترمال سایکلر (Thermal Cycler) دستگاهی است که تکنیک PCR در آن انجام می شود. ترموسایکلر به صورت سیکلیک دما را تغییر می دهد و موجب انجام واکنش PCR می شود. PCR یک تکنیک invitro می باشد که برای تشخیص هدفمند قطعات DNA به کار می رود.

در صورت تمایل می توانید راهنمای خرید دستگاه ترموسایکلر را مطالعه نمایید. این راهنما به صورت دقیق شما را در انتخاب یک دستگاه PCR مناسب راهنمایی می کند.

بهترین دمای annealing برای یک واکنش PCR کدام است؟

در واقع دمای Annealing برای پی سی آر بستگی به طول پرایمر درصد GC و اختصاصیت آن دارد. این عدد بین 50 تا 68 درجه سانتی‌گراد است و باید 5 تا 7 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمرها باشد. البته نکته ای که لازم است در نظر گرفته شود این است که کامل به نتایج بدست آمده از نرم افزارهای طراحی پرایمر اطمینان نکنید. بهتر است با دستگاه گرادیان ترموسایکلر اقدام به پیدا کردن دمای بهینه Annealing پرایمرها کنید. جهت تلفیق نتایج به‌دست‌آمده با نرم‌افزار، بهتر است دمای بهینه نرم‌افزار را به‌عنوان مرکزیت تعریف شیب دمایی جهت انجام PCR گرادیان اعمال کنید. مطمئناً موافق این موضوع هستید که به‌دست‌آوردن دمای بهینه Annealing به‌صورت آزمایشگاهی بهتر از دمای بهینه annealing به­دست ­آمده با نرم‌افزار به‌تنهایی است.

چرا mgcl2 در تکنیک PCR استفاده می شود؟

یونهای منیزیم به صورت mgcl2 به مستر میکس PCR افزوده می ­شوند. این یونها در واقع کوفاکتور آنزیم پلیمراز در طی واکنش پی سی آر هستند. در صورتی که مقدار این یون کم باشد موجب ایجاد نتایج تکثیر ضعیف یا حتی به طور کامل صورت نگرفتن واکنش PCR می باشد. اما درصورتی‌که زیاد باشد؛ به علت اتصال غیراختصاصی پرایمرها موجب خطای تکثیر غیراختصاصی باندها می‌شود. این امر موجب ایجاد باندهای بیشتر در الکتروفورز آگارز می­شود.

چرا نمی توان در واکنش PCR از RNA استفاده کرد؟

این امر به دلیل اختصاصی بودن DNA Polymerase می باشد. در واقع DNA Polymerase از اتصالات DNA دورشته­ای ایجاد و تک رشته ای DNA جهت تکثیر استفاده می کند. به­ همین دلیل باید درصورتی‌که لازم به تکثیر RNA باشد، ابتدا آن را به cDNA  تبدیل کرد. سپس در واکنش PCR به تکثیر آن پرداخته ­شود.

نکته دیگری که دررابطه با RNA قابل ذکر است و لزوم تبدیل آن به cDNA  را نشان می دهد، تجزیه شدن سریع آن توسط آنزیم های RNAse موجود در محیط است.

تاچ دان PCR چیست و چه کاربردی در تکنیک PCR دارد؟

تاچ دان PCR یا PCR تاچ دان یک روش پی سی آر است که به منظور جلوگیری از تکثیر قطعات غیراختصاصی طراحی شده است. دمای Annealing طی واکنش PCR تعیین کننده اختصاصیت اتصال پرایمرها می ­باشد. در این روش دمای ذوب پرایمرها  بالاتر از دمای Annealing ست می ­شود. در این دمای بالاتر از دمای ذوب جفت شوندگی تنها بین پرایمر و رشته الگو ایجاد خواهد شد. به دلیل ماهیت تکثیر نمایی در PCR ، اتصال غیر اختصاصی موجب  پایین آوردن شدید کیفیت نتایج PCR می ­شود.

همانگونه که شمای زیر نشان می دهد، مکانیسم کار بدین گونه است که در ابتدا با دماهای بالای Annealing موجب تکثیر کاملا اختصاصی قطعات DNA مد نظر شده و در سیکل های بعد دمای انیلینگ را کاهش داده تا احتمال تکثیر افزایش یابد. اما اتفاقی که همزمان می افتد کاهش احتمال تکثیر قطعات غیراختصاصی است.  

درواقع می ­توان اینگونه بیان کرد که تاچ دان PCR نوعی گرادیان پی سی آر است. در تاچ دان PCR کل بلاک ها در یک گرادیان دمایی در دمای انیلینگ قرار دارند. بنابراین اگر دستگاه ترموسایکلر از مدل معمولی باشد، می تواند خاصیت تاچ دان داشته باشد.

مرحله Final extension در تکنیک PCR:

پس از انجام سیکل آخر واکنش PCR، میکس PCR به مدت 5 الی 15 دقیقه در دمای Extensionقرار داده می شود. این دما معمولا 72 درجه سانتی گراد است. مدت زمان این گام آخر معمولا بستگی به طول امپلیکون و ترکیب بازی دارد. باید جهت اطمینان از پلیمریزاسیون کل امپلیکون و تکثیر مناسب قطعه DNA هدف این گام صورت پذیرد. لازم است دستگاه PCR خارج از سیکلها یک گام متفاوت تعریف کند.  همچنین نکته ای که در این گام صورت می­ گیرد؛ به خاطر داشتن زمان کافی ، آنزیم پلیمراز فرصت تکمیل کردن توالی های تکثیر شده به صورت ناقص و همچنین افزودن تغییرات لازم به توالی DNA مورد تکثیر را انجام دهد. به عنوان مثال، درصورتی که محصول PCR قرار است در وکتور TA cloning استفاده شود، پلیمراز زمان کافی جهت افزودن باقیمانده های A در انتهای ‘3 محصول PCR را خواهد داشت.

آنزیم PFU و taq DNA polymerase چه تفاوت هایی دارد؟

آنزیم taq DNA polymerase دارای سرعت بالای تکثیر DNA  (60 نوکلئوتید در ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد ) می باشد. در حالی که نرخ پلیمریزاسیون آنزیم PFU بین 9 تا 25 نوکلئوتید در ثانیه می باشد که تقریبا یک چهارم سرعت آنزیم taq pol می باشد.

اما نکته برتری آنزیم pfu در خاصیتی به نام proofreading می باشد که به این آنزیم اجازه می­ دهد با خاصیت 3′ به 5′ اگزونوکلئازی به تصحیح خطاهای خود در فرایند پلیمریزاسیون بپردازد. اما آنزیم taq pol فاقد این خاصیت است به گونه ای که با نرخ 1 به 9000 موجب ایجاد خطا می شود. از همین رو در صورتی که فقط بررسی وجود یا عدم وجود قطعه باشد می توان با taq تکثیر نمود اما در صورتی که فرایندهایی مثل کلونینگ و بیان مد نظر باشد بهتر لازم است از آنزیم با دقت بالا مثل pfu استفاده کرد.

کاربردهای تکنیک PCR  در شاخه های مختلف علوم زیستی

همانگونه که قبلا گفته شد تکنیک PCR به دلیل دقت بالا و سرعت خوب از تکنیک های مادر در علوم زیستی خصوصا حوزه علوم مولکولی می باشد. برخی از کاربردهای تکنیک پی سی آر عبارت است از:

1. تکثیر قطعات ژن به عنوان یک جایگزین سریع کلونینگ
2. اعمال تغییر بر روی قطعات DNA
3. تشخیص با دقت میکروارگانیسم ها
4. آنالیز DNA نمونه های باستانی
5. تشخیص جهش های مربوط به بیماری های وراثتی و همچنین جهش های مختلف مربوط به بیماری های بدخیم
6. آنالیز مارکرهای ژنتیک برای کاربردهای جنایی، تست والدین و صفارت ارثی
7. تکثیر قطعات DNA عناصر تکرار شونده اختصاصی گونه ها
8. مطالعات بیان ژن

دستگاه PCR دست دوم خارجی در ایران

یک موضوع جالب که همیشه در رابطه با دستگاه PCR خارجی شرکت با آن مواجهه بوده است، دست دوم و ریفربیش بودن تعداد زیادی از دستگاه های وارداتی برندهای معتبر جهانی است. شرکت دنا ژن با تجربه 1 دهه طراحی و تولید تجهیزات حوزه مولکولی تجربه زیادی در رابطه با خریداران دستگاه های ریفربیش شده دارد. بسیار پیش آمده که یوزر بعد از خرید این دستگاه ها در قطعات دستگاه تا گاها خارج شدن از فرایند کالیبر به مشکل برخورد کند و از این رو بعد از مدتی نیاز به خدمات داشته باشند.

معمولا برندهای بزرگ حوزه تجهیزات مولکولی نماینده رسمی در ایران ندارند و از روی اجبار خدمات پس از فروش پی سی آر خارجی به افراد فاقد صلاحیت سپرده می شود. این موضوع باعث می­ شود تعمیرات این کالاها به خوبی صورت نگیرد و دستگاه با قیمت گزاف بلااستفاده شود. این سری کالاها جزو کالاهای نیازمند به خدمات پس از فروش با درجه بالا محسوب می شوند.

توصیه می شود تا حد امکان از خرید دستگاه ترموسایکلر استوک و ریفربیش شده خودداری کنید و اصل اطمینان از خرید کالای الکترونیک نو و دارای خدمات پس از فروش معتبر را علی الخصوص برای دستگاه PCR به طور جد در نظر بگیرید.