تکنیک بلاتینگ
در تکنیک بلاتینگ باندهای پروتئینی از ژل به غشایی ماننده نیتروسلولز که قابلیت اتصال و تثبیت پروتئین ها را دارد، منتقل می شوند. در عمل بلاتینگ مولکول های پروتئین از زمینه ژل خارج می شوند و در سطح غشا در همان موقعیت قرار می گیرند. از این رو به سادگی و با مقدار کمتری از مواد می توان به مطالعه آنها پرداخت، یا آنها را جدا نمود و مورد استفاده قرار داد. در تکنیک بلاتینگ به منظور تشخیص پروتئین ها یا آنزیم های منتقل شده به غشا می توان از لیگاندهای اختصاصی یا سوبستراهای مربوطه استفاده کرد. آنتی بادی ها از متداول ترین موادی هستند که برای تشخیص اختصاصی پروتئین ها در غشا بکار می روند. از همین رو چنین روشهایی به ایمونوبلاتینگ معروفند.
روشهای انتقال پروتئین
دراغلب موارد انتقال پروتئین از ژل به غشا با کمک نیروی الکتریکی صورت میگیرد. این نوع انتقال به انتقال الکتروفورزی معروف است. انتقال الکتروفورزی به دو صورت انجام می شود: انتقال در تانک که به انتقال تر معروف است و انتقال به روش نیمه خشک.
البته می توان به طریق انتشار با خاصیت مویینگی یا پمپ خلا نیز پروتئین ها را انتقال داد.
روش انتقال در تانک (انتقال تر) شکل اولیه انتقال الکتروفورزی است.انتقال پروتئین ها در این روش در یک تانک پر از بافر که الکترودها در دو طرف آن قرار دارند، انجام می گیرد. روش دوم که به روش نیمه خشک است در سال های اخیر مقبولیت بیشتری پیدا کرده است. انتقال پروتئین ها در این روش، در بین دو الکترود که به شکل صفحه هستند، صورت می گیرد. روش نیمه خشک ساده تر و سریع تر است و در سیستم بافری پیوسته یا ناپیوسته قابل انجام است.
انتقال پروتئین ها از ژل به غشا از طریق انتشار، خاصیت مویینگی، یا با کمک پمپ خلا نیز امکان پذیر است. در انتقال به روش انتشار یک یا دو غشا؛ در یک یا دو طرف ژل قرار می دهند. در این حالت پروتئین ها از طریق انتشار از ژل به غشا انتقال می یابند. با افزایش درجه حرارت می توان انتشار را تسریع نمود. انتقال با خاصیت مویینگی معمولا برای انتقال DNA و در بعضی موارد برای انتقال پروتئین ها کاربرد دارد. در این روش غشا را روی ژل می گذارند و در هر طرف آن چند لایه کاغذ صافی قرار می دهند. ارتباط کاغذ صافی زیر ژل با بافر موجب حرکت مایع به طرف لایه های کاغذ بالا می شود و به این ترتیب پروتئین ها از ژل به غشا منتقل می شوند. روش انتقال با کمک خلا سریع تر و دقیق تر از روش های انتقال از طریق انتشار و خاصیت مویینگی است. برای انتقال پروتئین ها در این روش معمولا از پمپ خلا با فشار ضعیف استفاده می شود. از بین تمامی روش های ذکر شده روش انتقال نیمه خشک از دیگر روش ها ساده تر و دقیق تر بوده و مقبولیت بیشتری در بین محقیقن دارد.
غشاهای مورد استفاده در بلاتینگ
در عمل بلاتینگ معمولا از غشاهای نیتروسلولزی و یا پلی وینیلیدن دیفلورید (PVDF) استفاده می کنند. این دو غشا ظرفیت خوبی
در اتصال به پروتئین ها دارند. نیتروسلولز ارزان تر است ولی ظرفیت مکانیکی کمی دارد و شکننده می باشد. اندازه منافذ نیتروسلولز بین 05/0 تا 45/0 میکرون متغیر می باشند. هرچه اندازه منافذ یک غشا کوچک تر باشد سطح مخصوص و ظرفیت اتصال آن بیشتر خواهد بود. دی آزو بنزیل اکسی متیل (DBM) ، دی آزو فنیل تیواتر (DPT) و نایلون از دیگر غشاهایی هستند که در موارد خاصی از عمل بلاتینگ بکار می روند. غشاهای نایلونی از ظرفیت و توان مکانیکی بالایی برخوردارند، اما بر خلاف سایر غشاها بار مثبت دارند. از این رو اغلب رنگ های آنیونی که برای پروتئین مورد استفاده قرار می گیرند، به آنها متصل می شوند. در مواردی که جداسازی پروتئین خاصی از غشا مورد نظر باشد، استفاده از غشاهای تعویض یون برای بلاتینگ مناسب می باشد. برای این کار قسمتی از غشا که حاوی پروتئین مورد نظر است، جدا می شود. سپس با قرار دادن قسمت جدا شده در بافر با PH یا قدرت یونی متفاوت، پروتئین آزاد می شود.
روش انتقال در تانک الکتروفورز عمودی
روش انتقال در تانک شکل پای های انتقال به کمک الکتروفورز می باشد. بدین لحاظ غالبا این روش را معادل الکتروبلاتینگ میدانند. تصویر کلی این روش در شکل زیر آمده است.
معمولا انتقال در تانک در بافر تریس-گلیسین انجام می گیرد. این بافر برای جداسازی انواعی از پروتئین ها که به روش SDS-PAGE
جداشده اند مناسب است. وجود متانول در این بافر برای جلوگیری از تورم ژل، جداسازی SDS از پروتئین ها و بالا بردن ظرفیت
اتصال به غشا است. اما، متانول بخصوص در غلظت های بالا از عوامل بازدارنده انتقال پروتئین ها محسوب می شود. در بعضی موراد به منظور افزایش حلالیت پروتئین ها مقداری دترجنت (به عنوان مثال SDS با غلظت 02/0 درصد) به این بافر می افزایند. به هر حال باید توجه داشت که دترجنت ها به خصوص در غلظت های بالا از اتصال پروتئین ها به غشا جلوگیری می نمایند.
مواد لازم جهت انجام تکنیک ایمونوبلات
1- غشای نیتروسلولز با اندازه منافذ 45/0 میکرومتر یا غشای ایموبیلون (PVDF)
2- بافر انتقال حاوی تریس 25 میلی مولار، گلیسین 192 میلی مولار و متانول 15 درصد. برای تهیه آن 6 گرم تریس باز و 8/28 گرم گلیسین را در حدود یک لیتر آب مقطر حل کنید. سپس 200 میلی لیتر متانول اضافه کنید، حجم نهایی را با آب مقطر به 2 لیتر برسانید (PH این محلول حدود 3/8 است و نیازی به تنظیم ندارد). بافر را در یخچال قرار دهید تا قبل از استفاده خنک گردد، چون حل شدن متانول در آب گرمازاست.
3- کاغذ واتمن یا کاغذ الکتروفورز
روش آزمایش ایمونوبلات
1- مقداری از بافر تانک را در یک ظرف پلاستیکی یا شیشه ای تمیز بریزید. ژل را پس از بریدن بخش متراکم کننده آن حداقل 10
دقیقه در بافر قرار دهید.
نکته 1: ژل در این مدت به تعادل بافری میرسد. اگر ژل به تعادل بافری نرسد، جمع شدن آن هنگام انتقال صورت گرفته و باندهای
پروتئینی انتقال یافته به صورت اسمیر در می آیند. اگر بافر الکتروفورز بسیار متفاوت از بافر انتقال باشد، زمان بیشتری برای به تعادل رسیدن ژل لازم است. در ضمن باید توجه داشت که اگر درصد ژل بسیار کم باشد، قرار دادن آن به مدت طولانی در بافرانتقال ممکن است به انتشار و خروج پروتئین ها بیانجامد.
2- با کمک پنس و قیچی تمیز، یک ورقه از غشا به اندازه ژل ببرید. از تماس دست بدون دستکش با غشا خودداری کنید. غشا را با آب مقطر (برای غشای نیتروسلولز) یا متانول (برای غشای PVDF) خیس کنید و در ظرف حاوی بافر انتقال دهید. چندین لایه کاغذ صافی متناسب با ابعاد
ژل تهیه و همراه اسفنجها در بافر خیس کنید. سپس مطابق شکل زیر اجزای گفته شده را روی هم قرار دهید. این مجموعه از پایین به بالا شامل اسفنج، چند لایه کاغذ صافی، ژل، غشا، چند لایه کاغذ صافی و لایه اسفنج میباشد. بعد از گذاشتن هر لایه، حباب های
هوای احتمالی را با یک میله شیشه ای یا لوله آزمایش از حد فاصل لایه ها خارج کنید.
نکته 2: اگر ژل و غشا کاملا به هم نچسبند، پروتئین های جدا شده از ژل بطور دقیق منتقل نمی شوند و به حالت اسمیر در می آیند.
در ضمن حباب هوا بین ژل و غشا از انتقال پروتئین در آن نقاط جلوگیری می کند.
3- مجموعه بلات را در قاب پلاستیکی مربوطه محکم کنید و در تانک بلات که تا ارتفاع مناسب با بافر پر شده است، قرار دهید. سپس به مدت 1-4 ساعت در شدت جریان 200-400 میلی آمپر الکتروفورز نمایید.
نکته 3: مدت زمان مطلوب راب انتقال به عواملی مثل شدت جریان، اندازه پروتئین ها، درصد و ضخامت ژل و ترکیب بافر (قدرت یونی، درصد متانول و وجود دترجنتها) بستگی دارد. هر چه وزن مولکولی پروتئین، غلظت و ضخامت ژل و درصد متانول کمتر باشد زمان کمتری برای انتقال نیاز است. به این دلیل زمان مطلوب برای انتقال تجربی است. انتقال به مدت 2 ساعت در شدت جریان 3/0 آمپر می تواند مبنای مناسبی برای شروع باشد.
نکته 4: دمای 25 – 15 درجه سانتی گراد در اغلب موارد برای انتقال مناسب است. در حالتی که دستگاه بلات فاقد سیستم خنک کننده است، بهتر است انتقال در سردخانه یا یخچال و یا در جریان الکتریکی ضعیف تر انجام شود. می توان این کار را در طول شب با ولتاژ 20- 10 ولت انجام داد.
انتخاب بافر در الکتروبلات
انتخاب بافر و استفاده از متانول در بافر بستگی به نوع پروتئینهای مورد مطالعه، شرایط ژل، نوع الکتروفورز و نوع غشا دارد. همانگونه که قبلا ذکر شد، بافر تریس-گلیسین برای انتقال اغلب پروتئین ها مناسب می باشد. پروتئین ها در این بافر معمولا بار منفی دارند و به طرف آند حرکت می کنند. اتصال SDS به پروتئین ها (برای مثال در SDS-PAGE) نیز به تشدید بار منفی و حرکت آنها
کمک می کند. با این حال در بعضی موارد تغییر شرایط بافر تریس-گلیسین یا انتخاب بافر دیگر می تواند انتقال را تسهیل نماید. به عنوان مثال، تجربه نشان می دهد که با حذف متانول در بافر تریس-گلیسین انتقال گلیکوپروتئین های بزرگ به راحتی صورت می گیرد. متانول با زدودن SDS از پروتئین ها و جمع کردن ژل باعث کاهش انتقال این مولکول ها می شود. SDS یک دترجنت آنیونی است و در انتقال پروتئین ها (خصوصا پروتئین های با بار خالص مثبت) تاثیرگذار می باشد. بنابراین در صورت نیاز، علاوه بر حذف
متانول، میتوان درصد بسیار کمی از آن را وارد بافر کرد.
انتقال در بافر CAPS50میلی مولار سریعتر صورت می گیرد و با تولید گرمای کمتری همراه است. بدین لحاظ در صورت لزوم میتوان از این بافر به جای تریس-گلیسین استفاده کرد. در حالاتی که بلاتینگ به هدف تعیین توالی اسیدهای آمینه در پروتئین ها
صورت می گیرد، بافر CAPS مناسب تر است؛ زیرا حضور گلیسین در بافر موجب اختلال در تعیین توالی پروتئین ها می شود.
بافر بورات سدیم 10 میلی مولار با PH=9.2 برای انتقال گلیکو پروتئین ها، پلی ساکاریدها و لیپوپلی ساکاریدها توصیه می شود. در
این بافر، بورات به واحدهای قندی مواد فوق متصل می شود و به آنها بار منفی می دهد.
پروتئین های بازی که در شرایط اسیدی الکتروفورز می شوند، یا پروتئین هایی که با تکنیک ایزوالکتروفوکوسینگ جدا می شوند، را می توان در محلول اسیداستیک 7/0درصد به غشا انتقال داد. در این شرایط پروتئین ها بار مثبت دارند و به طرف قطب
منفی حرکت می کنند.
بعد از بلاتینگ پروتئین ها لازم است اطلاعاتی در مورد کیفیت و کمیت باندهای انتقال یافته بدست آید، یا پروتئین خاصی به هدف
مطالعات بعدی (مثلا تعیین توالی) مشخص گردد.
برای این کار میتوان غشای نیتروسلولز یا PVDF را با مواد مختلف رنگآمیزی نمود. رنگ آمیزی پروتئین ها بسته به هدف آزمایش ممکن است به صورت قابل برگشت و یا غیر قابل برگشت باشد. پانسو-اس، جوهرهندی، آمیدوبلک و کوماسی آبی از مواد متداول برای رنگ آمیزی عمومی پروتئین ها در غشا هستند. رنگ آمیزی ژل نیز کامل یا ناقص بودن انتقال پروتئین ها را نشان می دهد. باندهای پروتئین در ژل و غشا دقیقا هم موقعیت نمی باشند، زیرا ژل در طی متعادل سازی در محلول انتقال به دلیل وجود متانول،
مقداری کوچک می شود.
رنگ آمیزی قابل برگشت با پانسو- اس
محلول رنگ آمیزی شامل پانسو-اس 1/0 درصد وزنی- حجمی در اسید استیک 5 درصد حجمی – حجمی است. محلول آماده آن نیز توسط شرکت های مختلفی عرضه م یشود. برای رنگ آمیزی غشا را به مدت 5-10 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید. سپس با آب مقطر بشویید تا زمینه غشا بی رنگ گردد.
باندهای پروتئینی بعد از رنگ آمیزی به رنگ قرمز در می آیند. اگر شستشو با آب ادامه یابد، باندها نیز بی رنگ می گردند. رنگ آمیزی با پانسو-اس دخالتی در تشخیص باندها به روش اختصاصی (مثلا ایمونوبلاتینگ) یا در تعیین توالی اسیدآمینه ها ندارد. حساسیت این روش نسبتا پایین می باشد.
رنگ آمیزی قابل برگشت با آمیدوبلک
محلول رنگ آمیزی شامل آمیدوبلک با غلظت 01/0 درصد وزنی – حجمی در آب مقطر می باشد. برای رنگ آمیزی، غشا را 20-30 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید. سپس با آب بشویید تا زمینه غشا بی رنگ گردد. رنگ باندهای پروتئینی به تدریج ضعیف و بالاخره ناپدید می شود.
رنگ آمیزی غیر قابل بازگشت با کوماسی بلو
محلول رنگ آمیزی شامل کوماسی بلو R-250با غلظت 1/0 درصد وزنی حجمی در محلول اسید استیک 7 درصد حجمی- حجمی و متانول 50 درصد حجمی- حجمی در آب مقطر است.
محلول رنگ بر شامل اسیداستیک 7 درصد و متانول 50 درصد در آب مقطر است. رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو نیز با همین محلول ها صورت می گیرد.
غشا را 15 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید.محلول رنگ را تخلیه کرده، غشا را در محلول رنگ بر بشویید تا زمینه آبی آن بی رنگ گردد. سپس غشا را در آب مقطر بشویید.
کوماسی بلو برای رنگآمیزی پروتئین ها در PVDFمناسب است. این نوع رنگ را برای رنگ آمیزی نیتروسلولز بکار نبرید. زیرا زمینه آن شدیدا رنگی می شود.
رنگ آمیزی غیر قابل برگشت با آمیدوبلک
محلول رنگ آمیزی شامل آمیدوبلک آمیدوبلک 5/0درصد وزنی حجمی، اسید استیک 5 درصد حجمی- حجمی و متانول 50درصد
حجمی- حجمی در آب مقطر است.
محلول رنگبر شامل اسید استیک 5 درصد و متانول 50درصد در آب مقطر است.غشا را 5 دقیقه در محلول رنگ بر قرار دهید. محلول رنگ آمیزی را تخلیه کنید و غشا را با محلول رنگبر بشویید تا زمینه آبی رنگ شود.
رنگ آمیزی مارکرهای پروتئینی
تعیین برخی از خصوصیات پروتئینها همچون اندازه یا نقطه ایزوالکتریک (PI) با استفاده از مارکرهای پروتئینی صورت می گیرد. برای تشخیص مارکرها در غشا میتوان از روشهای زیر کمک بگیرید.
1- قسمت مربوط به مارکرها را از بقیه غشا جدا نمایید و با یکی از روش های غیر قابل برگشت که در صفحات قبل به آنها اشاره شد، رنگ آمیزی نمایید (PVDF را با کوماسی و نیتروسلولز را با آمیدوبلک رنگ کنید)؛ سپس این بخش از غشا را خشک نمایید و در کنار بقیه نتایج قرار دهید.
2- بسته به نوع برند موقعیت مارکرها و تعداد باندشان متفاوت است.
3- میتوان شکل بیوتینه شده مارکرها را تهیه کرد و یا مارکرها را در آزمایشگاه به بیوتین متصل نمود. تحت چنین شرایطی با در اختیار داشتن کونژوگه آویدین-پراکسیداز یا آویدین و کونژوگه آنتیآویدین-پراکسیداز می توان موقعیت مارکرها را مشخص نمود.
4- آلبومین مرغی و آلبومین گاوی از پروتئینهایی هستند که در بسیاری از انواع مارکرها وجود دارند. با در اختیار داشتن آنتیبادی ضد این دو پروتئین به صورت کانژوگه با آنزیم (یا آنتیبادی ضد آنها و آنتیبادی ثانویه کانژوگه) می توان موقعیت آنها را در غشا تعیین ساخت. این روش زمانی قابل اجرا است که از این پروتئین ها به عنوان ماده مسدودکننده در غشا استفاده نشود.
